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作者：王婧桥,张浩,焦一曦,洪夏飞,张靖承,吴文铭
文章来源：中华普通外科杂志, 2024, 39(5)
摘要
胰腺癌具有起病隐匿、恶性程度高、预后极差的特点。筛查及早期诊断是提高生存率、提高生活质量的关键。血液生物标志物具有无创、易于检测、可动态监测等特点，是胰腺癌早期筛查的潜在方法。本文总结了胰腺癌外周血生物标志物的研究现状，并对研究中的挑战进行阐述，以期为未来研究提供新思路。
一、临床常用的胰腺癌外周血标志物
临床常用的胰腺癌外周血标志物以蛋白标志物为主，包括CA19-9、CEA、CA125、CA242等。CA19-9对于胰腺癌的敏感性可达80%左右，但其在胰腺炎等良性疾病、其他胃肠道恶性肿瘤中均可升高，使假阳性率较高［3］。此外，有约10%的胰腺癌患者为Lewis抗原阴性基因型，该人群大多缺乏CA19-9的表达［4］，可能导致血清CA19-9检测并不适用。对于Lewis抗原阴性的胰腺癌患者，CEA与CA125有相对高的敏感性，分别为63.8%及51.1%，特异性均超过90%，其中CA125的升高可能提示较晚期的胰腺癌［5］。
二、胰腺癌外周血标志物的最新进展
（一）外周血液体活检
外周血液体活检通过检测循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）或循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）及外泌体（exosomes）等获取疾病信息，是胰腺癌筛查、诊断、预后及疗效判断的潜在手段。
1 CTCs
CTCs的检测步骤包括富集、分离、计数等，目前常用的系统基于生物学特性将EpCAM+、CK+、CD45-细胞定义为CTCs［6］。此外，基于细胞大小、密度等物理学特性的筛选平台，可提高EpCAM阴性CTCs的检出率［7］。既往研究表明，CTCs在胰腺癌中的检出率远不及其他肿瘤，在可切除胰腺癌患者中CTCs阳性与术后早期复发相关，提示不良预后［6，8］。由于CTCs在外周血中含量极低，常规血液采集量较难产生阳性结果，近期研究尝试通过诊断性白细胞分离术（diagnostic leukopheresis，DLA）富集更高血容量中的CTCs，可将M0及M1胰腺癌患者的阳性率提高至44%及74%［9］。即便如此，该方法的敏感性依然不理想，尤其对早期胰腺癌敏感性差，且采集方法复杂，成本高，并不适用于胰腺癌的筛查。对于癌前病变筛查而言，CTCs的作用更加有限。但一项研究显示胰腺导管内乳头状黏液瘤（intraductal papillary mucinous neoplasms，IPMN）患者外周血中循环上皮细胞（circulating epithelial cells，CECs）可用来进一步评估是否合并高级别异型增生［10］。
2 循环cfDNA及循环ctDNA
循环cfDNA是血浆中细胞凋亡、分泌或坏死所释放的DNA片段，其中来源于肿瘤细胞的DNA片段称作ctDNA，其特殊的基因突变可提示不同种类的肿瘤，在肿瘤危险分层、疾病监测及疗效评估等方面有潜在应用价值［11］。ctDNA在外周血中稳定性较差，在标本处理过程中易降解，可能导致阳性率降低［12］。KRAS突变在胰腺癌中占比约90%，其他常见突变基因包括TP53、SMAD4、CDKN2A等，通过数字PCR、二代测序等手段可从外周血ctDNA中检出此类突变，既往研究中基于ctDNA的KRAS阳性率为40%~77%，检出率随疾病进展升高［13, 14］。作为疾病监测手段，ctDNA-KRAS检测可用于识别治疗后微小残留病灶（minimal residual disease，MRD）［14］。化疗起始时ctDNA携带KRAS突变的进展期胰腺癌患者中，ctDNA-KRAS对于治疗反应监测的敏感性及特异性优于CA19-9及CEA［15］。一项近期研究表明，ctDNA状态可在CT尚未提示疾病进展的不可切除胰腺癌患者中预测治疗效果，提示ctDNA阳性可能与药物疗效不佳存在关联［16］。动态监测进展期胰腺癌患者ctDNA水平提示，治疗初期ctDNA水平显著降低，而ctDNA水平升高可显著早于影像学提示疾病进展［17］。此外，术前及术后ctDNA阳性患者的无复发生存期及总生存期显著低于ctDNA阴性患者，提示ctDNA可提供预后信息［18］。基于cfDNA启动子甲基化检测的研究显示ADAMTS1甲基化状态对于胰腺癌诊断的敏感性及特异性为87.2%及95.8%，BNC1为64.1%及93.7%，联合检测两个基因的甲基化状态对于Ⅰ/Ⅱ期胰腺癌的敏感性及特异性为94.8%及91.6%，优于CA19-9［19］。由此可见，胰腺癌筛查中cfDNA及ctDNA的可挖掘空间较大，其表观遗传学信息亦可用于肿瘤筛查。此领域尚处于起步阶段，当前研究中cfDNA/ctDNA的检测灵敏性有限，且检测成本高，未能投入临床应用。目前已有小规模的临床试验（PREVAIL trial）证实了ctDNA在辅助胰腺癌诊断中的价值，提出了“先血液、后组织”（blood first，tissue second）的胰腺癌诊断策略，为ctDNA投入临床应用进行了初步实践［20］。
（二）血清微小RNA（microRNA，miRNA）
miRNA是一种非编码单链RNA，在体内参与多种生理、病理过程，在肿瘤的发生发展中有重要的调节功能［21］。miRNA的稳定性、组织特异性较好，且易于检测，是具潜力的胰腺癌生物标志物之一。既往研究重点关注外周血循环miRNA及外泌体源性miRNA的诊断效能。一项研究在外周血标本中检测17种胰腺肿瘤组织高表达的miRNA，发现4种血浆miRNA（miR-21-5p，miR-33a-3p，miR-320a，miR-93-5p）对诊断胰腺癌或IPMN有较好的准确性，联合检测miR-33a-3p+miR-320a+CA19-9的诊断效能最佳［22］。一项近期研究结合多中心公开数据集及实验室数据，筛选出3种在肿瘤组织及血清中均升高的miRNA（hsa-miR-1246，hsa-miR-205-5p，hsa-miR-191-5p），并发现其能较准确地识别胰腺癌［23］。
肿瘤细胞高表达的miRNA可被包载在外泌体内，外泌体源性miRNA浓度更高，活性、稳定性更好。一项多中心队列研究发现联合检测5种循环miRNA（miR30c-5p，miR340-5p，miR335-5p，miR23b-3p，miR142-3p）及8种外泌体源性miRNA（miR145-5p，miR-200b-3p，miR-429，miR-1260b，miR-145-3p，miR-216b-5p，miR-200a-3p，miR-217-5p）对于Ⅰ/Ⅱ期胰腺癌的敏感性及特异性为80%及91%，且能有效识别绝大多数CA19-9阴性的患者［24］。一项针对我国人群的多中心研究筛选出6种外泌体源性miRNA的组合（miR-130a-3p，miR-1228，miR-21-5p，miR-223-3p，miR-7975，miR8069），其对鉴别胰腺癌与其他胰腺肿瘤、慢性胰腺炎、健康对照的效能均显著优于CA19-9［25］。
虽然已有较多研究探索了循环及外泌体源性miRNA对于胰腺癌诊断的效果，但各研究提出的标志物重合度较低，反复验证其效能将是临床转化的关键。未来的临床研究旨在寻找并验证稳定、可重复的miRNA诊断标志物组合。
（三）血液蛋白标志物
传统的血液蛋白标志物检测主要包括免疫测定法及质谱法。近年来，检测技术迅速发展并被应用于胰腺癌血液标志物的发掘，包括邻位延伸分析技术（proximity extension assay，PEA）、表面等离子共振技术（surface plasmon resonance，SPR）等［26, 27］。新型检测技术可提高检测通量，扩大筛选范围，有助于寻找随瘤负荷增加而稳定变化的潜在标志物。
有学者提出MIC-1在鉴别胰腺癌和健康人群方面优于CA19-9，在早期胰腺癌患者中，即使肿瘤负荷较小，也可以检测到MIC-1的升高，这揭示了其在胰腺癌早期诊断和筛查中的价值［28］。THBS2是近年来较受关注的蛋白标志物，其识别Ⅰ期可切除胰腺癌的能力与晚期胰腺癌相仿，与CA19-9联合检测可显著提高敏感性及特异性［29］。除辅助诊断外，蛋白标志物亦可用于预后判断、疗效监测等。
近年来，有较多研究在CA19-9的基础上挖掘标志物组合，得出的标志物组合包括CA19-9+POSTN+CA242、CA19-9+TIMP1+LRG1等［30, 31］。一项近期研究基于血清学及组织学筛选差异表达糖肽，表明胰腺癌组织相关糖肽谱可作为潜在的血清糖肽标志物，其异质性可作为个体化诊疗的基础，但此类糖蛋白组学特征是否适用于早期胰腺癌及癌前病变有待考究［32］。有高通量筛选研究提出了多种蛋白组合［33］，但此类组合筛选范围有限，且成本较高。由此可见，虽然既往蛋白标志物组合研究结果提示了该筛查模式的潜力，但胰腺癌蛋白标志物领域的发展进程并不十分理想，距离临床转化还有一定距离。
（四）其他类型标志物
除上述标志物外，近年来也有研究挖掘了包括聚糖、脂质等其他类型生物标志物。一项研究提出聚糖sTRA（sialylated tumor-related antigen）是有临床转化潜力的生物标志物，可在CA19-9阴性的胰腺癌中检出，既能用于高危人群的疾病监测，也能用于胰腺疾病的鉴别诊断［34］。血清透明质酸（hyaluronan）及Ⅲ型胶原蛋白前肽（propeptide of type Ⅲ collagen）亦能作为血清标志物，用于胰腺疾病的鉴别诊断及预后评估［35］。上文中miRNA为较常见的肿瘤标志物类型，此外多种小RNA均参与肿瘤发生发展过程并可成为生物标志物。环形RNA（circular RNA，circRNA）是一种可结合和调节miRNA的非编码RNA，一项近期研究联合血清外泌体及肿瘤组织筛查，识别重叠的差异表达circRNA并构建circRNA-miRNA-mRNA网络，证实了circRNA作为胰腺癌生物标志物的可行性［36］。
（五）多组学检测
有较多研究进行血清蛋白、miRNA、ctDNA、外泌体源性蛋白及小RNA等多种标志物的多组学检测。一项近期研究发现联合检测CA19-9、TIMP1及cfDNA的胰腺特异性甲基化能提高对早期胰腺癌的诊断效能［37］。有研究联合检测血清及外泌体蛋白，发现CA19-9+Exo-GPC1+Exo-CD82可有效鉴别胰腺癌与健康对照或胰腺炎患者［38］。相比血液循环标志物，外泌体源性标志物稳定性更好，且肿瘤源性外泌体在外周血中占比可观，是肿瘤标志物领域的新兴研究方向［39］。
高危人群中的胰腺癌早筛方面，一项近期研究筛选出了一组包含5种蛋白及3种miRNA的标志物组合，可有效识别高危IPMN，且能比当前的指南标准更准确地进行危险分层［40］。此外，基于外周血的多癌种多组学检测可能是未来肿瘤筛查的方向，一项近期研究通过外周血多组学检测试图筛查包括胰腺癌在内的8种常见恶性肿瘤及19种少见肿瘤，发现其敏感性及特异性均可观，为一般人群的大规模筛查提供思路［41］。未来研究可通过包括ctDNA、蛋白、miRNA等标志物的多组学检测，不断提高诊断效能，旨在高危人群中鉴别早期胰腺癌。
三、研究中的挑战
近些年胰腺癌筛查及早期诊断相关研究逐渐增多，提出了较多潜在标志物，但这些标志物大多未能投入临床应用。基础研究仍是标志物挖掘创新的基石，应基于胰腺癌发生发展机制、肿瘤代谢通路有针对性地选择外周血肿瘤标志物。具有高潜力的标志物应在胰腺癌患者中升高倍数多、随瘤负荷增加而浓度变化趋势明确。检测技术的进步使检测的深度、广度有显著提高，为大规模筛查标志物提供了基础［42, 43］。多组学研究的迅速发展为胰腺癌筛查与诊断提供了新思路，联合检测可提高敏感性与特异性，但相比单一类型标志物组合检验复杂、成本高，临床可行性需进一步验证。
既往研究中多将Ⅰ、Ⅱ期胰腺癌定义为早期胰腺癌，此人群包括部分肿瘤直径较大、已出现淋巴结转移的患者，预后不良，而极早期的癌变（如高级别异型增生、原位癌）未被应用于此类研究，因此标志物对于真正早期的胰腺癌诊断效能不详［44］。针对此难点，可留取高癌变风险人群术前标本，根据病理结果建立原位癌队列，基于该群体寻找对低瘤负荷仍敏感的标志物。
高效、规范的队列建设及维系也是当前研究中的重点与难点。由于胰腺癌发病率较低，在普通人群中进行筛查可行性低，需先建立胰腺癌高危人群队列［44］。对高危人群进行长期随访势必能观察到肿瘤发生，可在该人群中测试新型筛查手段，同时验证该筛查模式的临床可行性。此类队列建设是胰腺癌早筛研究的必经之路，但仍存在较多急需解决的问题，包括标准化病历管理、规范化标本采集及保存、多中心大规模数据库建立等。
四、小结
外周血生物标志物具有便捷、安全、性价比高、患者接受程度高等诸多优势，既往研究结果提示其具有较好的临床应用前景。因此，发掘新型优质标志物并在胰腺癌高危人群队列中验证其效果迫在眉睫，是未来重点研究方向。近年来胰腺癌外周血标志物领域迅速发展，筛选出了包括液体活检、miRNA、蛋白等多种类型的潜在标志物。多组学检测可进一步优化检测效能，具有一定的临床转化价值，且已有国内外团队积极开展临床试验。随着对胰腺癌疾病认知的不断提升以及检测手段的继续发展，相信未来可寻找到有效的胰腺癌无创诊断及早期筛查手段。
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