基于UPLC-MS/MS的代谢组学，分析HMBOX1对RAW264.7细胞增殖的影响

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文| 夙夜玖歌

编辑| 夙夜玖歌

介绍

巨噬细胞作为肿瘤进展和免疫调节中的重要效应细胞，在肿瘤发生发展中起关键作用。新的证据表明，许多巨噬细胞是从卵黄囊和胎儿肝的祖细胞中建立的，然后通过自我增殖和单核细胞补充维持。

巨噬细胞的增殖通常有助于其在肿瘤或炎症性疾病中的积累；因此，抑制巨噬细胞的增殖可以防止疾病的进展。巨噬细胞水平升高与肿瘤促进表型相结合与患者的不良结果有关。不出所料，巨噬细胞被认为是肿瘤免疫治疗的一个重要靶点。

含有新型人类转录的抑制基因同源盒（HMBOX1）具有一个含有78个氨基酸的非典型同源盒结构域和一个推测的HNF1N结构域，在细胞增殖、凋亡、分化和免疫调节中发挥作用。

此前发现HMBOX1在自然杀伤（NK）细胞中作为干扰素γ（IFN-γ）的转录抑制因子，并通过抑制肝炎症来保护LPS/d-galn诱导的急性肝损伤。进一步研究发现，肝细胞中NF-κB/CCL2信号转导存在负调控。然而，HMBOX1对巨噬细胞活性和增殖的调控作用尚未得到详细研究。

谷氨酰胺作为人体中最丰富的氨基酸，提供了一种能量底物，并作为其他氨基酸的前体，包括谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸，谷氨酰胺的其他重要代谢物包括氨、乳酸和丙酮酸。

最近的综述强调了谷氨酰胺功能在巨噬细胞中的重要性，是一种代谢活跃的免疫细胞，需要谷氨酰胺及其代谢产物来合成蛋白质。此外，谷氨酰胺代谢深刻影响巨噬细胞的增殖和激活，据报道，10 mM谷氨酰胺可增加RAW264.7proliferation和活力。谷氨酰胺已被证明在一般促进细胞增殖，通过溶质载体（SLC）家族的谷氨酰胺相关转运体。

因为谷氨酰胺是亲水和水溶性的，SLC转运蛋白（如SLC1、SLC6、SLC7和SLC38）有助于携带细胞外谷氨酰胺通过细胞膜，特别是SLC1A5 。SLC1A5对氨基酸代谢的影响使其成为细胞增殖的重要调节因子。其他SLC1A5底物包括天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和半胱氨酸，所有这些也都与细胞的新陈代谢有关。虽然在过表达hmbox1的RAW264.7细胞中观察到SLC1A5水平较低，但其对巨噬细胞生物学行为的具体影响尚不清楚。

细胞转染成瘤性检测的生物技术

将RAW264.7细胞以2×105细胞/孔的密度置于6个板上，转染hmbox1过表达质粒或空白载体6h，在37℃下培养24 h。在慢病毒转导方面，将RAW264.7细胞镀于6孔板上，用含有hmBOx1过表达质粒）的慢病毒上清液转导8h。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次后，细胞在DMEM中培养48小时，然后用1.0µg/mL嘌呤霉素培养5天后使用。将HMBOX1过表达的RAW264.7细胞以2×105细胞/孔的密度镀于6个板上，转染SLC1A5过表达质粒或空白载体6h，然后在37℃下培养24 h。然后收集细胞，用于后续的实验。

代谢物提取

转导RAW264.7的慢病毒质粒转导的hmbox1264.7与LPS（10 ng/mL）孵育6h。在37°C下用3 mL PBS（Sigma-Aldrich）洗涤后，用冰水提取细胞（每5×106个细胞1 mL）溶液（甲醇-乙腈-水=40：40：20，v/v)。

然后，细胞在4°C下用超声处理30 min，并在14,000×g下离心20 min。收集上清液，真空干燥，用乙腈水溶液（1：1，v/v）重新溶解，然后转移到高效液相色谱（HPLC）小瓶中。

统计分析

用ropls R包对数据进行多变量pareto尺度主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。通过7倍交叉验证和响应排列检验来评估模型的稳健性。

计算了OPLS-DA模型的每个组成部分的投影（VIP）中的变量重要性，以确定其对分类的贡献。使用独立学生的t检验来确定组间的差异。如果VIP>为1和p
<为0.05，则认为代谢物发生了显著变化。采用皮尔逊相关分析来评估变量之间的关系。< p="">

HMBOX1对RAW264.7增殖的影响

将过表达HMBOX1的慢病毒质粒转导RAW264.7细胞，观察到HMBOX1水平升高.分别在24、48、72和96 h收集细胞进行CCK8检测，结果显示RAW264.7细胞的增殖能力下降。克隆形成试验也得到了类似的结果。这些结果表明，HMBOX1对RAW264.7细胞的增殖有显著影响。

HMBOX1对lps诱导的RAW264.7激活的影响

转染了pcDNA3.1-HMBOX1质粒或对照，RAW26用LPS（10 ng/mL）刺激4.7细胞24 h。与对照组相比，lps刺激的RAW264.7细胞上清液中TNF-α和IL-6水平显著降低。同时，与对照组相比，过表达hmbox1的RAW264.7细胞的吞噬能力受损，而中性红阳性巨噬细胞的百分比较低。这些结果表明，HMBOX1对RAW264.7细胞的活化有显著影响。

对照组和hmbox1过表达组之间的差异代谢物谱

对照组和hmbox1过表达组的细胞代谢物的总离子色谱（TIC）被鉴定为HILIC正离子或负离子模式。在此基础上，使用化合物发现者软件对数据进行处理，得到了一个包含1312种代谢物的基质，包括脂质、核苷酸、有机酸和有机氮。将获得的数据导出到R包中，使用PLS-DA、PCA和OPLS-DA模型进行多元统计分析。OPLS-DA评分散点图显示两组间有明显差异。OPLS-DA模型的置信度检验结果也表明，在OPLS-DA模型中不存在过拟合现象。

对照组和hmbox1过表达组中差异代谢物的鉴定

表达hmbox1的巨噬细胞的代谢物表达显著不同（倍数变化[FC]>1.5或<0.67和p<0.05）。对差异代谢物的KEGG分析结果显示，它们参与了相同的代谢过程或细胞途径。

此外HMBOX1过表达影响多种类型的氨基酸和核苷酸代谢，如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，以及嘧啶代谢。氨基酸和核苷酸代谢的差异代谢产物。这些结果共同提示了HMBOX1在RAW264.7细胞代谢中的调节作用。

讨论

虽然代谢组学是一个相当新的领域，但它已经对巨噬细胞功能[41–43]的研究做出了重要贡献。在这里，我们应用代谢组学来证明该转录抑制因子HMBOX1下调细胞内谷氨酰胺水平以阻断巨噬细胞增殖。蛋白质组学和体外实验表明，HMBOX1可能抑制SLC谷氨酰胺相关转运体的表达。这些结果表明，HMBOX1在巨噬细胞相关的免疫性疾病中具有重要的调控作用。

代谢组学分析还显示了许多其他被HMBOX1显著抑制的氨基酸，包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、脯氨酸和嘧啶。这些效应可能是由于谷氨酰胺代谢作为合成其他细胞内成分的材料来源的重要性。例如，谷氨酰胺中的酰胺氮是生物合成所必需的，而体内细胞利用谷氨酰胺产生嘌呤、嘧啶和其他氨基酸。

为了探讨谷氨酰胺对巨噬细胞增殖的影响机制，我们将过表达hmbox1的RAW264.7细胞培养于添加2mmol/LL-谷氨酰胺的DMEM培养基中。

然而，在培养基中，l-谷氨酰胺的增加并没有改善HMBOX1对细胞增殖的抑制功能，表明细胞外介质中谷氨酰胺的水平足以促进细胞生长，和HMBOX1抑制RAW264.7细胞的增殖主要与抑制细胞内谷氨酰胺的运输有关，而可能与细胞外谷氨酰胺的水平无关。

在研究中HMBOX1下调了巨噬细胞谷氨酰胺转运体SLC1A5的水平，并且观察到巨噬细胞中谷氨酰胺水平下降，以及各种氨基酸和嘧啶核苷酸的代谢下调与以前的报告一致。所有这些数据均表明了HMBOX1通过靶向slc1a5相关的谷氨酰胺转运来抑制细胞增殖能力的机制。

其具体的调控机制有待进一步研究。此外的蛋白质组学分析显示，HMBOX1抑制了谷氨酰胺转运体和谷氨酰胺酶的表达（抑制10%），但没有抑制谷氨酰胺合成酶或谷氨酰胺脱氢酶的表达。因此，HMBOX1似乎对谷氨酰胺的运输很重要，但对其代谢并不重要。

除SLC家族转运体外，过表达HMBOX1后，植物鞘氨醇水平显著提高。有报道称，植物鞘氨醇通过线粒体介导的通路诱导细胞凋亡，这可能是HMBOX1抑制RAW264.7增殖能力的另一种机制，这也可能是SLC1A5升高后细胞增殖部分恢复的原因之一。

除了促进细胞增殖外，谷氨酰胺还支持巨噬细胞的免疫功能，包括吞噬作用、促炎细胞因子的合成/分泌和抗原呈递]。Jiang等人报道，谷氨酰胺作为m1样巨噬细胞代谢重编程的碳氮源。我们的研究表明，HMBOX1显著抑制了lps诱导的巨噬细胞M1的活化，并降低了M1相关的细胞因子和细胞吞噬能力。

本研究的证据表明，HMBOX1抑制谷氨酰胺细胞内运输是一个重要的因素。因此，HMBOX1/slc1a5介导的谷氨酰胺摄取下调可能是HMBOX1在肝脏炎症中的保护作用的机制之一。

HMBOX1升高也被证明影响巨噬细胞的鞘磷脂代谢；脂质鞘磷脂约占巨噬细胞膜的25%，参与吞噬、溶酶体稳定、受体介导的趋化、抗原呈递和tlr4介导的先天免疫应答的调节。因此，鞘磷脂代谢可能是HMBOX1作用于调节巨噬细胞免疫功能的另一个途径。然而，其机制尚不清楚，还需要进一步的研究来证实这一假设。

结论

研究结果表明，HMBOX1通过调节RAW264.7细胞中多种代谢物的水平和相应的代谢途径来抑制RAW264.7细胞的增殖和M1激活。

hmbox1抑制SLC1A5功能影响RAW264.7细胞的增殖和生物学功能。这些数据支持了我们之前关于HMBOX1抑制巨噬细胞增殖和M1激活功能的研究。本研究结果为进一步探索HMBOX1在巨噬细胞生物学功能中的作用提供了基础。