原子力显微镜（AFM）原理与应用

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工欲善其事，必先利其器，几十年来，有许多用于表面结构分析的现代仪器先后问世。

如透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、场电子显微镜（FEM）、场离子显微镜（FIM）、低能电子衍射（LEED）、俄歇谱仪（AES ）、光电子能谱（ESCA）、电子探针等。这些技术在表面科学各领域的研究中起着重要的作用。

但任何一种技术在应用中都会存在一定的局限性，例如，LEED 及X 射线衍射等衍射方法要求样品具备周期性结构，光学显微镜和SEM 的分辨率不足以分辨出表面原子，高分辨TEM 主要用于薄层样品的体相和界面研究，FEM 和FIM 只能探测在半径小于100nm的针尖上的原子结构和二维几何性质，且制样技术复杂，可用来作为样品的研究对象十分有限；还有一些表面分析技术，如X射线光电子能谱(ELS)等只能提供空间平均的电子结构信息；有的技术只能获得间接结果，还需要用试差模型来拟合。此外，上述一些分析技术对测量环境也有特殊要求，例如真空条件等。

1985年，IBM公司的Binning和Stanford大学的Quate研发出了原子力显微镜（AFM），弥补了STM的不足，可以用来测量任何样品（无论导电性与否）的表面，表1为显微镜技术的各项性能指标比较。

表1 显微镜技术的各项性能指标比较

01 电子显微镜的背景

1932年：透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）。德国物理学家恩斯特、卢斯卡创造了第一台电子显微镜。这种显微镜是通过发射电子穿过极薄的标本切片来成像的，对于观察细胞的内部结构非常有用，TEM能把标本放大50万倍。

1965年：扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）。它把电子束发射到标本的表面（而不是穿过标本），然后形成标本外观的精细三维图像，SEM能把标本放大15万倍。

1981年：扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscopy，STM）；IBM-Zurich的Binnig and Rohrer发明，通过检测从标本表面逸出的电子成像，科学家用它可以观察到细胞外层上的单个分子，STM能把标本放大100万倍。

1985年，原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）。Binnig, Gerber和Quate开发成功了首台原子力显微镜。

20世纪70年代，提出了冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy，Cryo-TEM），2013年12月5日，美国加州大学旧金山分校以近原子分辨率（3.4埃），确定了在疼痛和热知觉中起中心作用的一种膜蛋白TRPV1的结构，标志着冷冻电镜正式跨入“原子分辨率”时代。

02 AFM原理

AFM的原理较为简单，它是用微小探针“摸索”样品表面来获得信息。

当针尖接近样品时，针尖受到力的作用使悬臂发生偏转或振幅改变。悬臂的这种变化经检测系统检测后转变成电信号传递给反馈系统和成像系统，记录扫描过程中一系列探针变化就可以获得样品表面信息图像。

AFM是在STM的基础上发展起来的。所不同的是，它不是利用电子隧道效应，而是利用原子之间的范德华力（Van Der Waals Force）作用来呈现样品的表面特性。

假设两个原子一个是在悬臂的探针尖端，另一个是在样本的表面，它们之间的作用力会随距离的改变而变化，其作用力与距离的关系如下图所示，当原子与原子很接近时，彼此电子云斥力的作用大于原子核与电子云之间的吸引力作用，所以整个合力表现为斥力的作用，反之若两原子分开有一定距离时，其电子云斥力的作用小于彼此原子核与电子云之间的吸引力作用，故整个合力表现为引力的作用。原子力显微镜就是利用原子之间微妙的关系来把原子样子给呈现出来。

03 AFM成像模式

（1）接触式

接触式AFM是一个排斥性的模式，探针尖端和样品做柔软性的“实际接触”，当针尖轻轻扫过样品表面时，接触的力量引起悬臂弯曲，进而得到样品的表面图形。由于是接触式扫描，在接触样品时可能会是样品表面弯曲。经过多次扫描后，针尖或者样品有钝化现象。

特点：通常情况下，接触模式都可以产生稳定的、分辨率高的图像。但是这种模式不适用于研究生物大分子、低弹性模量样品以及容易移动和变形的样品。

（2）非接触式

在非接触模式中，针尖在样品表面的上方振动，始终不与样品接触，探测器检测的是范德华作用力和静电力等对成像样品没有破坏的长程作用力。

需要使用较坚硬的悬臂（防止与样品接触）。所得到的信号更小，需要更灵敏的装置，这种模式虽然增加了显微镜的灵敏度，但当针尖和样品之间的距离较长时，分辨率要比接触模式和轻敲模式都低

特点：由于为非接触状态，对于研究柔软或有弹性的样品较佳，而且针尖或者样品表面不会有钝化效应，不过会有误判现象。这种模式的操作相对较难，通常不适用于在液体中成像，在生物中的应用也很少。

（3）轻敲式

微悬臂在其共振频率附近做受迫振动，振荡的针尖轻轻的敲击表面，间断地和样品接触。当针尖与样品不接触时，微悬臂以最大振幅自由振荡。当针尖与样品表面接触时，尽管压电陶瓷片以同样的能量激发微悬臂振荡，但是空间阻碍作用使得微悬臂的振幅减小。反馈系统控制微悬臂的振幅恒定，针尖就跟随表面的起伏上下移动获得形貌信息。

类似非接触式AFM，比非接触式更靠近样品表面。损害样品的可能性比接触式少（不用侧面力，摩擦或者拖拽）。

轻敲模式的分辨率和接触模式一样好，而且由于接触时间非常短暂，针尖与样品的相互作用力很小，通常为1皮牛顿（pN）～1纳牛顿（nN），剪切力引起的分辨率的降低和对样品的破坏几乎消失，所以适用于对生物大分子、聚合物等软样品进行成像研究。

04 AFM制样及测试

（1）制样流程

AFM制样时，对样品导电与否没有要求，因此测量范围比较广泛。

图1 AFM制样流程

（2）测试及结果分析

以氧化石墨烯AFM结果为例：

图2 GO的AFM图样

05 AFM应用技术举例

AFM可以在大气、真空、低温和高温、不同气氛以及溶液等各种环境下工作，且不受样品导电性质的限制，因此已获得比STM更为广泛的应用。主要用途有：

（1）导体、半导体和绝缘体表面的高分辨成像，三维形貌观测

例如，AFM 在水平方向具有0.1-0.2nm 的高分辨率，在垂直方向的分辨率约为0.01nm。尽管AFM 和扫描电子显微镜（SEM）的横向分辨率是相似的，但AFM 和SEM 两种技术的最基本的区别在于处理试样深度变化时有不同的表征。由于表面的高低起伏状态能够准确地以数值的形式获取，AFM 对表面整体图像进行分析可得到样品表面的粗糙度、颗粒度、平均梯度、孔结构和孔径分布等参数，也可对样品的形貌进行丰富的三维模拟显示，使图像更适合于人的直观视觉。

图3 二氧化硅增透薄膜AFM图和光栅的AFM图

图3a就是接触式下得到的二氧化硅增透薄膜原子力图像，同时还可以看到其表面的三维形貌。图3b为光栅的AFM 图像，在半导体加工过程中通常需要测量高纵比结构，像沟槽和孔洞，以确定刻蚀的深度和宽度。这些在SEM 下只有将样品沿截面切开才能测量。AFM 可以无损的进行测量后返回生产线。

（2）生物样品、有机膜的高分辨成像

例如：利用高速原子力显微镜(HS-AFM)可以在分子水平上观察膜上抗菌肽的活性。

图4 AFM观察到的抗菌肽的变化

由图4可知暴露几十分钟后，可观察到的结构发生了变化，成像观察到“凹陷”，膜厚度减小的圆形区域，与低聚物(图4a)一起以瞬时速度(0.7±0.5µm/s)在膜上扩散。另外，观察到酒窝簇(图4c)，以前没有在文献中描述过，稍微让人想起立方相，静态地位于膜上，尽管内部动态重排在几秒钟的时间尺度上(图4d)。

原子力显微镜成像速度，取决于每一个像素的扫描时间。当粒子相对于显微镜的扫描速度快速移动时，粒子在显微镜扫描一个像素的时间内遍历几个像素，在这种情况下，不可能定义粒子所在像素的每一帧;该粒子在图像中未被分解。为了分辨所述粒子，所述粒子必须至少在显微镜扫描所述一个像素所需的时间内驻留在一个像素的区域内。

（3）表面化学反应研究

（4）纳米加工与操纵，生物样本的自组装过程观察。

图5 HS-AFM观察Ca2+存在下A5自组装对富ps膜的影响

（5）超高密度信息存储

（6）分子间力和分子动力学研究

图6 AFM以毫秒时间分辨率监测构象变化

如图6，可以利用AFM表征野生型细菌视紫红质在连续光和短脉冲下的单分子动力学，以毫秒时间分辨率监测其构象变化。

（7）摩擦学及各种力学研究

（8）在线检测和质量控制

原子力显微镜具有以下优点：

（1）样品无需导电；

（2）能在多种环境（如真空、大气、液体、低温等）下工作；

（3）能得到物体表面的高分辨三维像；

（4）能对单细胞、单分子操作，如细胞膜上打孔、切割染色体等。