文/小野传说

编辑/小野传说

前言

近年来，大量的工业、农业、生活废水排入地表水，使其污染日益严峻，水体中的污染物多以混合物的形式出现，单一污染物几乎不存在，研究表明，由浓度低于无可观测效应浓度(NOEC)的单一污染物质组成的混合物，依然会对生态环境造成不利影响，因此，针对多元混合物联合毒性的研究至关重要。

至今为止，毒理学领域当中应用最为广泛的联合毒性预测模型是浓度加和(CA)模型和和独立作用(IA)模型，CA模型一般用于预测各组分具有相似作用模式(MOAs)的混合物毒性，IA模型通常用于各组分具有不同MOAs的混合物。

当混合物中某一单体化合物不具有完整的剂量效应曲线(例如：抑制率0-90%)，CA模型在预测中存在预测盲区。

研究发现，在多物种水平或生态系统水平上评估混合物的影响时，约20%的混合物只能用IA预测，只有10%的混合物只能用CA预测，部分混合物可以用两种模型预测；数据表明，当细菌为试验生物时，IA是最好的模型。

虽然两种模型都低估了效应浓度，但IA模型比CA的方法表现更好，因此，研究采用IA模型对混合物的组合毒性进行评价。

物质剂量效应曲线的特性参数k∙ECx可以表征CRCs的形态走势，效应残差比(effectresidualratio，ERR)可以量化联合作用，且能有效表征不同效应水平，特别是低效应水平下CA和IA模型预测值与观测值之间的偏差。

课题组从CRC几何形态角度研究混合物的联合毒性，提出用各组分的特性参数k∙ECx的方差(σ2(k∙ECx))表征多元混合物CRC的形态差异，确定了σ2(k∙ECx)与联合毒性ERR之间的函数关系，研究进一步讨论混合物的σ2(k∙ECx)数值与联合作用方式与强度之间的关系。

为了涵盖不同形态的CRCs，选取4种类型的11种化学物质作为受试毒物，包括1种重金属，2种表面活性剂，2种抗生素，6种离子液体。

受试毒物按CRC的特性参数k∙ECx的差异分为两组，即参数k∙ECx相近的5元混合物和k∙ECx相异的7元混合物，借助对外源化学物质敏感，且易于观察发光性变化的海洋细菌费氏弧菌为受试生物，旨在探明参数σ2(k∙ECx)与混合物联合作用强度和方式的变化规律，进一步拓展其在环境风险评估和污染控制中的应用。

材料与方法

重金属氯化镉(CdCl2·2.5H2O，CAS：7790-78-5，＞98%)，表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDBS，CAS：25155-30-0，＞95.0%)和十二烷基硫酸钠(SDS，CAS：151-21-3，＞97.0%)。

多黏菌B硫酸盐(PLB，CAS：1405-20-5，＞95%)，盐酸四环素(TC，CAS：64-75-5，＞98.0%)。

离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐(IL1，CAS：151-21-3，＞97.0%)、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(IL2，CAS：244193-52-0，＞97.0%)、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(IL3，CAS：244193-50-8，＞97.0%)、1-十二烷基-3-甲基咪唑氯盐(IL4，CAS：114569-84-5，＞99%)。

冻干粉将保存于4℃冰箱中的菌板置于超净台上，在无菌条件下用接种环挑取2个单菌落至80mL液体培养基中(培养基按照国际标准化组织(ISO)11348-3(2007)的标准方法制备和保存)，置于转速为180r/min的恒温震荡培养箱中，20℃培养21h±1h。

待菌液生长至OD575=1.20取出，用2%NaCl调至菌悬液发光值在120~140万相对光单位(relativelightunit,RLU)待用，在96孔标准不透明板中进行微孔板毒性分析。每组试验使用三批次细菌悬液，结果的差异必须小于10%。

为了充分探究不同浓度比混合物的毒性，研究采用以最少试验次数，评估混合物联合毒性的最佳测试技术，均匀设计(UD)射线法进行混合物的设计。

均匀表和使用表设计了各组分对应k∙ECx数值相近的7组混合物，采用EECR法设计1组等效混合物，其中每种化学品的浓度比分别为EC50，记为S组(Similar)，命名为S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6和S-7。

均匀表和使用表设计了各组分对应k∙ECx数值相异的10组混合物，采用等效效应浓度比(EECR)法设计1组等效混合物，其中每种化学品的浓度比分别为EC50，记为D组(Different)，命名为D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7、D-8、D-9、D-10和D-11。

通过非线性最小二乘法和OriginPro2018，获取单一化学物质及多元混合物的CRCs，用CRCs的95%置信区间(CI)表征实验误差和拟合不确定度，所有的CRCs通过Hill函数拟合，c(mg/L−1)为测试样品的浓度；a为极限浓度对应的效应；b(mg/L−1)为产生a/2效应对应的浓度；n为斜率的参数。

利用CRC拟合函数的反函数和导数函数分别计算曲线效应x%处的浓度ECx和斜率ki，因CRC形态差异较大时，CA模型在预测联合作用时将产生巨大误差，由于PLB的最大效应仅为50%，致使CA模型在预测D组混合物毒性时会出现盲区。

因此，研究沿用课题组前期研究方法，采用IA模型进行混合物联合毒性的量化，Cmix为混合物的总浓度；E(Cmix)为混合物的总效应；E(ci)为第i个组分独立存在且其浓度为ci时产生的效应。

ERRx为联合作用，Ex,prd和Ex,obs分别为特定浓度水平(ECx)下，IA模型预测的效应值和实验观察的效应值，ERRx=0，＞0，＜0时分别表示加合作用、拮抗作用和协同作用，|ERRx|表示联合作用强度的大小[13]。

σ2(k∙ECx)为混合物抑制率为x%时，各组分参数k∙ECx的方差，σ2(k∙ECx)的详细计算过程参照已发表的文献，18个混合物的σ2(k∙ECx)与联合作用ERRx符合指数函数关系。

结果

化学品的CRCs均可被Hill函数很好的拟合，其中，校正的相关系数平方(Adj.R2)值均高于0.975，标准化的简化卡方检验(Red.Chi-S’)值均低于0.0018，以EC50评估物质的毒性，11种化学物质的毒性大小顺序为：IL4＞Cd2，+＞PLB＞IL6＞IL2＞SDS＞SDBS＞TC＞IL5＞IL3＞IL1，与Yu等研究IL3>IL1毒性大小顺序一致。

基于长链咪唑和吡啶的离子液体对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌和藻类具有更广泛的抗菌活性，因此IL4在此11种化合物中表现出最强抑菌效果，甚至高于重金属Cd的毒性，IL1毒性很弱，但它可以抑制超氧化物歧化酶(SOD)活性，导致功能和酶活性的丧失，暴露于高浓度IL1，可能会对生物体带来不可逆转的损害，甚至是细胞凋亡。

前期研究表明，参数k∙ECx可以在整个浓度范围内表征CRC的形态走势，S组混合物各组分(5种离子液体)k∙ECx的变化趋势，S组各组分的k∙ECx在整个浓度区间，均符合先增大再减小的规律，且对应K∙ECx的数值相差较小，例如，IL2、IL3、IL4、IL5和IL6的k∙EC50分别是65.14、59.19、68.68、59.66和60.93。

D组Cd2+、TC、IL1、IL2和PLB的k∙ECx符合先增大再减小的规律，PLB相对特殊，最大抑制率仅50%，其k∙ECx的极值点为k∙EC30，与课题组前期研究结果相同，因此，D组混合物各组分的对应k∙ECx数值相差较大，Cd2+、SDBS、TC、SDS、IL1、IL2和PLB的k∙EC50分别是102.19、63.90、76.28、20.63、35.41、54.57和4.29。

18个混合物的CRCs均可被Hill方程很好地拟合，所有的Adj.R2均大于0.981，相应的Red.Chi-S’均小于0.0015，D组Cd2+在D-9中浓度占比最大，毒性最强；IL1在D-2中浓度占比最大，其毒性最弱。

S组IL4在S-3中浓度占比最大，其毒性最强；IL3在S-6中的浓度占比最大，其毒性最小，可见，混合物的联合毒性与单一化合物的毒性强弱相关，两组混合物的实测CRCs和IA模型预测的CRCs(IA-CRCs)，根据实测的CRCs与IA-CRCs偏离程度确定混合物的联合作用。

D组混合物的实测毒性曲线均与IA-CRCs发生明显偏离，产生了较强的协同或拮抗作用；混合物D-2、D-4、D-5、D-7、D-8、D-10和D-11均发生联合作用方式的改变，低浓度为拮抗作用，中高浓度为协同作用S组混合物的实测CRCs均与IA-CRCs发生轻微的偏离，且无联合作用方式的转变，表现为较弱的协同作用。

前期研究了具有J型和S型剂量效应曲线的二元混合物的联合作用，结果显示混合物在不同效应浓度水平均表现为拮抗作用。

在这之后，小组研究了四种具有不同剂量效应趋势，不同规格试剂二元混合物对月牙藻(绿藻属)及聚球藻(蓝藻属)的毒性作用，结果均出现较大程度的协同或拮抗作用。

由此可知，混合物的联合作用具有一定的变化规律，参数k∙ECx整体形态相差较大的混合体系其联合作用的强度更大，且易发生联合作用方式的改变，反之，其联合作用的强度较小。

在自然环境中，混合物种类千差万别，这种由于物质CRCs形态差异而引起的联合作用强度以及方式的变化应引起人们的重视。

混合物σ2(k.ECx)与联合毒性(ERRx)的函数关系利用ERRx模型，量化混合物的联合作用后，提升了研究结果准确性，采用各组分的参数k∙ECx的方差(σ2(k∙ECx))表征混合物CRC的形态差异，拟合发现：σ2(k∙ECx)与ERRx仍符合指数函数关系。

所有的Adj.R2均高于0.964，Red.Chi-S’均低于0.013，显示了混合物由低浓度到高浓度σ2(k∙ECx)与ERRx的变化关系，前期研究按照曲线函数类型的变化将混合物分为两种类型，A类混合物，发生联合作用模式的转变；B类混合物，联合作用模式保持不变。

为方便分析，画辅助线ERRx=0，D组D-2、D-4、D-5、D-7、D-8、D-10和D-11为A型，D-1、D-3、D-6和D-9为B型，A型混合物占比64%；S组混合物均为B型，D组和S组混合物ERRx的值域分别为[80.31,-69.96]和[-3.26,-49.55]，表明CRC曲线形态整体差异大的混合物体系易出现A型混合物，且产生较强的联合作用。

σ2(k∙ECx)是反映混合物各组分CRC形态差异的参数，有相关研究结果可知，D组和S组混合物的σ2(k∙ECx)的值域分别为[0.14,207.41]和[0.075,454.52]，均出现较大的σ2(k∙ECx)，CRC曲线形态整体差异较小的S组甚至出现了更大的σ2(k∙ECx)。

究其原因是混合物的设计采用UD射线法，混合物内各组分的毒性效应不同，以S-4为例，IL2、IL3、IL4、IL5和IL6的浓度效应比为EC50、EC30、EC5、EC40和EC10，σ2(k∙ECx)为该浓度比下各组分参数k∙ECx(x取值不同)的方差，因此该混合物具有较大的σ2(k∙ECx)值。

结论

利用IA和ERRx模型对CRC整体形态相异的D组和相似S组共18个多元混合物进行毒性评价，混合物的σ2(k∙ECx)和ERRx都很符合指数函数关系。

D组混合物产生了较强的拮抗或协同作用，64%的混合物发生了联合作用方式的转变。S组混合物产生较弱的协同作用。

即CRC整体形态差异较大(参数k∙ECx相差较大)的混合体系会产生较强的联合作用，且易发生联合作用方式的改变；CRC整体形态相似的混合体系，联合作用强度较小，且联合作用方式不易改变。