mRNA质量检测之poly A尾检测方法

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首先我们需要先回顾下3’端polyA尾的功能：保护帽结构不被降解，与polyA结合蛋白、5’ Cap（帽结构）和翻译起始因子蛋白协同作用，启动蛋白质的翻译。多数mRNA的polyA长度为50–200 nt，以维持正常的生物学功能。polyA尾的有无与长度是mRNA药物的关键质量属性之一。

当前polyA尾的检测分为两种思路：

① 与加帽率的分析策略类似，酶切后纯化回收3’端polyA尾，随后通过毛细管电泳（CE）、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、高效液相色谱（HPLC）或液相色谱质谱联用（LC-MS），对polyA尾进行定性和定量分析。

② 基于二代或三代测序技术表征polyA，已报道的测序方法包括TAIL-seq、PAL-seq、FLAM-Seq和PAIso-Seq等。

2018年诺华公司Beverly M等发表在Anal Bioanal Chem杂志的一篇文章，《Poly A tail length analysis of in vitro transcribed mRNA by LC-MS》，研究基于RNAse T1酶切与oligo dT磁珠纯化得到polyA尾，使用液相色谱质谱联用（LC-MS）检测polyA尾长度的分布，目前该策略是当前mRNA体外制备工艺中较为常用的方法。

2022年Brouze A等发表在Wiley Interdiscip Rev RNA期刊的一篇综述，《Measuring the tail: Methods for poly(A) tail profiling》，总结了利用二代（Illumina）或三代（PacBio）测序与RNA直接测序平台检测polyA尾，可在分析polyA长度分布的同时表征序列的完整性和准确性。

01

基于内切酶与LC-MS平台的polyA尾检测

1）mRNA样品制备

一步法加尾：设计模板序列，包括不同长度polyA尾（27-112 nt），体外转录（IVT）制备mRNA样品。

酶法加尾：模板序列不包括polyA，使用大肠杆菌来源的polyA聚合酶进行mRNA的加尾修饰。制备得到的mRNA进行琼脂糖凝胶电泳，确认mRNA样品的长度和完整性。以10 nt和20 nt 的polyA为标准品。

2）RNAse T1酶切与磁珠纯化

① 酶切：内切酶RNAse T1可特异性地在单链RNA的鸟嘌呤核糖核苷酸（G）后进行切割。100 pmol mRNA加热至95℃后迅速降至25℃，随后加入10×RNase H缓冲液、2 μl RNase T1酶（100 μl体系），37℃孵育3小时。

② 纯化：通过polyA尾与oligo dT磁珠特异性结合进行纯化，使用0.1 M醋酸铵溶液清洗磁珠，随后加入75%甲醇，80℃孵育1 min，洗脱polyA片段。③换液：通过旋转蒸发去除甲醇，重悬于含1%甲醇的0.1 mM EDTA溶液，用于LC-MS分析。

3）LC-MS分析

使用高分辨液相质谱联用仪，固定相为ACQUITY C18色谱柱，流动相A为200 mM六氟异丙醇+8.15 mM三乙胺（pH 7.9），流动相B为100%MeOH。

洗脱条件为：5%B洗脱1min，1-12 min内B浓度由5%线性增加到25%，然后90%B冲洗1min后恢复5%B。紫外波长设置为260 nm。

4）不同加尾方法得到的polyA尾长度评估

与利用质粒模板转录生成polyA相比，酶法加尾的mRNA样品的出峰更宽，polyA尾长度的分散性更大。

图1 不同加尾方法得到的polyA尾分布（离子色谱图）

5）HPLC与MS的分辨率

当polyA长度为27 nt时，高效液相色谱（HPLC）可有效分离相差一个腺苷的polyA，但当碱基个数增加至64或100，HPLC未能有效分离相差一个腺苷的polyA（图2a）。而质谱（MS）可弥补这一缺陷，当polyA长度为100 nt，电喷雾质谱图可精确检测任一不同分子量的polyA（即不同长度的polyA），通过峰强度对polyA长度分布进行相对定量（图2b）。

图2 mRNA样品的polyA尾分析（上图为离子色谱图,下图为电喷雾质谱图）

如上所述，文章介绍了一种分析mRNA polyA尾长的方法。该方法基于RNase T1将polyA从mRNA序列上切割下来，通过dT磁珠特异性捕获polyA，然后借助LC-MS的高分辨率，定量分析mRNA的polyA尾长度分布。

基于该策略的可替代方法包括：根据核苷酸序列特性，使用其他RNA酶（如RNase A或RNase H）代替RNase T1，以获得polyA片段，随后通过毛细管电泳、HPLC对短核苷酸进行分离与定量分析。

02

基于测序平台的polyA尾检测

有研究报道，可利用Illumina二代测序、PacBio三代测序与纳米孔RNA直接测序平台分析polyA，测序原理及流程如下：

1）基于Illumina平台分析polyA尾

Illumina RNA-Seq的原理是通过富集mRNA（polyA富集）或去除rRNA，产生片段化的RNA序列，然后将RNA逆转录生成双链cDNA，在片段末尾加入测序接头后进行PCR扩增。cDNA分子聚集在流动池，通过DNA合成体系中的3’端封锁荧光标记的核苷酸底物读取荧光信号，从一端（单端测序）或两端（成对末端测序）进行测序。

常用的方法包括TAIL-Seq和PAL-Seq，借助于制备完整的包括polyA尾在内的3’端mRNA测序文库。首先将RNA与生物素化的3’端DNA接头连接，并用RNase T1部分酶切，留下完整的polyA尾，随后使用链霉亲和素磁珠捕获3’端片段。通过凝胶电泳筛选不同条带，并与5’端接头连接，为逆转录、文库扩增和测序提供完整的模板。如图3所示，PAL-Seq和TAIL-Seq的不同在于DNA接头，TAIL-Seq仅存在一个单链DNA接头，测序过程需去除rRNA。而PAL-Seq技术除单链DNA接头外，还存在一端与polyA尾和3’端接头互补的DNA寡核苷酸序列，提高了连接效率，因此不需去除rRNA。

Illumina测序技术的不足在于，由于polyA的长多聚物特性，容易产生PCR扩增的偏倚，保真度较低，序列准确性较低。

图3 基于Illumina平台的polyA尾测序方法

2）基于PacBio平台分析PolyA尾

不同于Illumina短cDNA片段合成测序的方法，PacBio采用单分子实时测序技术，在处理均聚物的效果优于Illumina，可对全长RNA分子进行测序，提供有关polyA的长度和序列信息。

常用方法包括FLAM-Seq和PAIso-Seq。如图4所示，两种方案的主要步骤是3’端延伸、逆转录、cDNA扩增、环状接头连接和PacBio测序。

二者的不同点为：

FLAM-Seq首先选择带有polyA尾的mRNA，随后对其进行G/I加尾。逆转录引物由5’末端的PCR handle组成，然后在模板置换寡核苷酸（TSO）的情况下合成第二链，最后将合成的双链cDNA扩增并进行PacBio测序。而PAIso-Seq首先与oligo dT结合，3’末端延伸，经USER降解oligo dT寡核苷酸，随后经逆转录、PCR扩增双链cDNA并进行PacBio测序。PacBio具备均聚物测序能力，可用于分析polyA尾的序列组成。

图4 基于PacBio平台的polyA尾测序方法

3）基于纳米孔RNA直接测序平台分析polyA尾

纳米孔RNA直接测序平台由Oxford NanoporeTechnologies（ONT）推出，与二代、三代测序相比，纳米孔RNA直接测序技术分析polyA尾不需进行PCR，流程如图5所示，将3’端接头连接至mRNA（含polyA），逆转录（可选操作）后连接至3’端测序接头（与动力蛋白连接），随后被加载到纳米孔形成的流动池，施加电压后，在动力蛋白驱动下，RNA由3’端至5’端通过纳米孔，根据特异性电流信号分辨碱基序列。纳米孔RNA直接测序平台不需切断mRNA序列，直接读取全长序列；该平台不依赖于逆转录和PCR反应，可以同时表征序列的完整性、准确性和核苷酸修饰。

图5 基于纳米孔RNA直接测序平台的polyA尾检测方法

03

结语

2018年Beverly M等使用内切酶RNase T1进行特异性切割，利用磁珠分离得到5’端polyA尾，随后通过LC-MS有效分离不同分子量大小的核苷酸序列，从而定量分析polyA尾长度分布。该方法是体外合成mRNA polyA尾的常用表征方法。

随着测序技术的发展，科学家们开始基于测序平台分析polyA尾长度。基于Illumina平台的TAIL-Seq和PAL-Seq技术，以及第三代测序技术PacBio平台，通过构建cDNA文库对polyA尾或全长mRNA进行测序，可检测polyA尾长度和序列完整性。但二者均依赖于PCR扩增cDNA，长均聚物的存在导致PCR扩增不可避免地存在偏差，可能对polyA尾长和序列准确性造成影响。ONT开发的直接测序方法，不依赖于逆转录与PCR扩增，可以实现polyA尾部长度及序列准确性的检测，不存在PCR偏倚性。然而以TAILseq、PALseq、FLAMseq、PATseq及纳米孔测序为代表的测序技术通量大、设备要求高，鉴于体外合成的mRNA通量较小，无法体现测序技术的高通量优势。