《Advanced Science》：多功能杂化纳米平台为肿瘤研究提供新思路

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低氧条件下光动力疗法（PDT）和化疗耐药性是抗肿瘤治疗中的大问题。中枢神经系统肿瘤的靶向纳米平台同样迫切需要。为了解决这些问题，近日，来自南京大学的王忠长、朱海亮教授团队、南京医科大学邹美娟教授团队和郑州大学附属儿童医院段勇涛教授团队进行了多功能蛋白杂化纳米平台用于通过同源靶向结合氧运输协同光动力-化疗治疗恶性肿瘤的相关研究。相关研究成果以“Multifunctional Protein Hybrid Nanoplatform for Synergetic Photodynamic-Chemotherapy of Malignant Carcinoma by Homologous Targeting Combined with Oxygen Transport”为题于2022年12月21日发表在《Adv. Sci.》上。

图1 实验流程及思路

本文设计了新的多功能蛋白杂化纳米平台，由实体肿瘤识别剂转铁蛋白（TFR）和血红蛋白供氧（ODP-TH）组成。蛋白混合框架封装了光敏剂原卟啉IX和化疗剂多柔比星，通过谷胱甘肽反应性二硫键连接。从机制上讲，ODP-TH穿过血脑屏障（BBB），通过蛋白质同源性识别特异性聚集在缺氧肿瘤中。氧气和包裹的药物通过下调多药耐药基因1（MDR1）和缺氧诱导因子-1（HIF-1）的丰度促进肿瘤治疗。结果显示，ODP-TH在缺氧肿瘤占位中实现氧气运输和蛋白质同源识别。与传统的光动力化疗相比，ODP-TH实现更高效的肿瘤抑制效果。本研究不仅通过靶向氧转运克了联合治疗中与缺氧相关的抑制作用，而且实现对乳腺癌、胶质瘤等多种肿瘤的有效治疗，为构建有前景多功能靶向强化抗肿瘤纳米平台提供一个新的概念。

图2 ODP-TH纳米平台的合成和表征

ODP-TH合成后，透射电镜和动态光散射（DLS）显示，ODP-TH具有规则光滑的球形，直径为30.2±1.2nm。为研究ODP-TH是否成功合成，研究人员采用尺寸排除色谱法。结果显示，ODP-TH质量明显高于原始TRF和Hb质量，表明形成了包括TRF和Hb新物质。在ODP-TH溶液中也检测到少量原始TRF和Hb。ODP-TH紫外-可见吸收光谱呈现TRF和Hb特征性吸收峰，以及Dox和PpIX的吸收峰。接着为了验证过量GSH处理会使TRF和Hb通过双键交联。通过测量游离巯基浓度来确定是否可以形成二硫键。半胱氨酸溶液中游离巯基浓度用作基准。结果发现TH纳米壳溶液中游离巯基的浓度明显低于Hb或TRF基团浓度，表明这两个基团是通过二硫键交联。ODP-TH成功合成。

图3 ODP-TH在体外的细胞毒性和氧气传输能力

纳米材料低毒性是其在体内体外安全应用的前提。研究人员将小鼠乳腺癌4T1细胞与不同浓度TH纳米壳共同培养，没有药物封装。结果显示TH纳米壳显示生物低毒性性能。接着研究单个封装的纳米颗粒，P-TH和D-TH在体外抗肿瘤治疗的表现。结果显示P-TH+激光组表现出比PpIX组更好的抗肿瘤活性，而在D-TH和Dox组也具有类似结果。表明药物抗肿瘤活性在纳米材料包裹后得到提高。然后研究人员分析ODP- TH携带的氧气是否能提高其治疗效果。结果显示ODP-TH+激光组对4T1细胞的杀伤效果明显优于DP-TH和PpIX+Dox+激光组。表明ODP-TH减轻了TME的缺氧状态，增强了药物的效果。在细胞凋亡的早期阶段，线粒体膜电位发生了不可逆的变化。ODP-TH+激光组中PDT随着氧气引入产生更多细胞毒性单线态氧，增强的靶向性导致更多Dox在癌细胞中积累。反过来又导致线粒体膜电位下降。流式细胞仪也得到同样的结论。细胞毒性单线态氧的产生对PDT至关重要，ODP成功释放了氧气，并在癌细胞中产生大量的ROS。

图4 单线态氧的产生和缺氧相关的ODP-TH免疫荧光成像

PDT过程产生大量ROS，单线态氧在光动力效应中起着关键作用。为评估纳米平台PDT效果，在注射后4小时用单线氧传感器绿（SOSG）测试体内单线氧生成。结果显示PpIX组没有明显单态氧生成，因为氧气供应不足和肿瘤组织中光敏剂太少。OP-TH组与P-TH组形成明显对比，较大的绿色区域表明有更多单态氧产生。肿瘤中PpIX的积累和充足氧气供应归因于纳米平台在缺氧TME中实现的出色药物靶点输送和可持续氧气释放。免疫荧光结果也证实上述观点。与ODP-TH组相比，PpIX和P-TH组亮红色区域表明HIF-1-仍在肿瘤组织中广泛表达。在P-TH组中极度缺氧组织绿色区域比PpIX组稀疏，但在OP-TH组中消失。总之以上结果表明，OP-TH为有毒肿瘤组织提供充足氧气供应，缺氧状态得到极大的缓解。在P-TH和OP-TH组观察到大量红色信号，揭示大量PpIX的存在，证实纳米平台的精确给药性能。

图5 ODP-TH纳米平台在体内和体外穿越BBB的情况以及协同治疗效果

为探索ODP-TH的BBB穿越能力，用Transwell小室在体外建立BBB模型，采用实时成像的方法检测药物输送。给药4小时后，ODP-TH给药组有明显Dox和PpIX的荧光。对照组Dox和PpIX荧光不明显。ODP-TH组中，U87MG细胞迅速摄取纳米颗粒，并在细胞内释放了大量的Dox和PpIX。实验组平均Dox和PpIX荧光强度分别是对照组7.9和9.9倍。这种明显吸收差异原因是ODP-TH纳米平台外壳上的TRF能与U87MG细胞中过量表达的TFRs相互作用并介导跨膜运输。许多纳米颗粒成功穿过BBB，并在U87MG细胞中通过GSH介导释放Dox。些药物分子未能穿过BBB，通过简单扩散被肿瘤细胞吸收。此外体内成像系统评估纳米平台在动物模型中穿过BBB的性能也显示同样结论。总之，ODP-TH纳米平台具有良好BBB穿透能力，为其治疗中枢神经系统疾病方面的前景提供体外实验支持。与PBS组相比，ODP-TH+激光组的肿瘤抑制率达到97.2%，表明ODP-TH纳米平台具有良好的肿瘤抑制能力。纳米平台治疗组的小鼠体重保持在稳定水平，证明ODP-TH纳米平台高度生物安全性。肿瘤细胞的细胞核缩小或变得破碎。与对照组相比，ODP-TH+激光组的HIF-1、Ki-67和MDR-1表达明显下降。

总之，本文构建了一个多功能纳米平台ODP-TH，结合肿瘤靶向聚集和协同治疗特点，具有比单体Hb更好的携氧能力，方便携带氧气并在肿瘤深层缺氧部位自动释放氧气，大大缓解TME缺氧状况。此外，TRF和TFRs同源相互作用比NPs更精确针对ODP-TH，NPs只依赖对目标图EPR效应。药物分布显示，注射后48小时，封装在ODP-TH中的PpIX和Dox在肿瘤部位含量丰富，归因于ODP-TH较小直径和同源靶向功能。ODP-TH为PDT提供了必要的材料，大大缓解化疗中的耐药性问题。在体内和体外抗肿瘤实验表明，ODP-TH的抗肿瘤效果优于PDT与化疗相结合的效果。因此，多功能纳米平台ODP-TH为癌症治疗提供了一种更深入的方法，具有良好的应用前景。

文章来源：

https://doi.org/10.1002/advs.

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