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«——【·前言·】——»
昆虫被认为是最成功的动物群体，就各种生态位的多样性和生存能力而言，昆虫体内的微生物群落含有许多具有生物技术重要性的重要细菌物种。
这些细菌利用各种有机聚合物，可能属于产甲烷和固氮细菌，据报道，昆虫的肠道菌群也有重要的过程，例如信息素和维生素的合成，杀虫剂的降解和防止病原体攻击。
这就是为什么昆虫的总微生物群落和肠道菌群，都是具有潜在生物技术重要性的新型分离株的良好来源。。
据估计，昆虫肠道含有比昆虫总细胞多10倍的微生物，比动物基因多100倍的微生物基因。
栗子瘿蜂，Dryocosmus kuriphilus Yasumatsu（膜翅目：Cynipidae），是全球最重要的栗子害虫之一，在亚洲到美洲和欧洲的各个国家都有发现。
2014年在土耳其首次报道，目前存在于亚罗瓦和布尔萨地区.D. kuriphilus被认为是全球栗树物种的主要害虫，会减少果实产量。
人们对针对有害昆虫的更有效和致病细菌控制剂的兴趣日益浓厚，从栗子中分离和表征细菌，以获得用于生物防治的新微生物制剂，还讨论了细菌分离株的其他潜在生物技术应用。
«——【·昆虫的收集·】——»
2014年，从位于土耳其马尔马拉地区布尔萨省和亚罗瓦省的板栗田收集了D. kuriphilus幼虫，在无菌条件下收集幼虫并立即运送到实验室。
通过宏观检查区分活幼虫和死幼虫，幼虫在70%酒精中表面灭菌，然后在无菌蒸馏水中洗涤三次，并使用玻璃组织研磨机在营养液培养基中均质化。
悬浮液被稀释（从 10−1到 10−8），并将每种悬浮液的0.1mL接种在营养琼脂上，将板在30°C下孵育2-3天，孵育期后，检查平板并选择细菌菌落，然后通过平板上的传代培养纯化菌落。
«——【·细菌分离株的鉴定·】——»
根据细菌分离株的形态学（细胞形态、内孢子形成和迁移率）和生化特性（革兰氏染色、氧化酶和过氧化氢酶试验）对细菌分离株进行检查和鉴定。
还使用分析概况索引API 20E，API 50CH和API STAPH测试系统测定细菌分离株的生化特性。
将细菌菌落接种到营养肉汤中，并在DNA提取前在18°C下孵育约30小时，在孵育时间结束时，通过离心从培养基中收集细菌细胞，然后，使用基因组DNA纯化试剂盒分离基因组DNA。
27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′作为反向）的寡核苷酸引物用于扩增16S rRNA基因。
PCR混合物含有5 μL 5× Taq DNA聚合酶反应缓冲液，每种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）各200 μmol/L，10 pmol引物，1.5 U Taq DNA聚合酶，3 mmol/L氯化镁2和 5 μL 基因组 DNA，最终反应体积为 50 μL。
在以下条件下进行：在2°C下初始变性94分钟，35个变性循环（45°C下94秒），退火（60°C下55秒）和延伸（60°C下72秒），并在72°C下最终延伸10分钟。
最后，在1%琼脂糖凝胶中电泳分析PCR产物，然后用溴化乙锭染色在紫外（UV）下观察。
PCR产物由RefGen生物技术实验室测序，相同的引物对用于测序，所得序列用于分离株鉴定和系统发育分析。以确认分离物鉴定。
评价了7种细菌分离株的进化关系。使用BioEdit和Clustal W对序列进行聚类分析，然后使用MEGA 0，用软件对比序列进行邻接分析，使用MEGA 1000.6通过自举分析0次重复测试树状图的可靠性。
«——【·结果与讨论·】——»
人们越来越有兴趣寻找更有效和致病的细菌控制剂来对抗有害昆虫，尽管迄今为止对栗木蝴蝶进行了大量生物防治研究，但对栗子菌的分离和表征一直被忽视。
从栗子中分离出四种细菌分离株，两种孢子形成菌株和两种非孢子形成菌株，并测出了这些细菌分离株的一些形态和生物特征。
Dk1分离株为革兰氏阳性、非孢子形成、非运动、球菌形、过氧化氢酶阳性和氧化酶阴性，营养琼脂上有奶油色菌落。
根据常规测试、API 20E、API 50CH、API STAPH、形态学和生化特征以及部分16S rRNA序列分析，将该分离株鉴定为腐生葡萄球菌，分离出的Dk1先前已从红火蚁幼虫，红火蚁和粉蝽，根茎蚧中分离出来。
关于树红链球菌作为生物控制剂潜力的少数报告之一表明，树红链球菌可用于控制牛蜱、扇头蜱。
在某些条件下，葡萄球菌可在完全充血的蜱虫中引起致命感染，但这些细菌感染充血雌性的潜在机制尚未阐明，以更好地评估腐生链球菌作为控制牛蜱和扇头蜱传播疾病的替代方法的潜力。
除了生物防治外，腐生链球菌还被用于其他一些生物技术应用，例如，腐生链球菌可用于通过生物吸附从工业废水中去除或回收重金属离子，特别是铅和铬离子。
生产溶葡萄球菌素，这是一种具有潜在临床应用的葡萄球菌溶菌素，并被证明在食品工业中也有可能用作生物防腐剂。
腐生葡萄球菌是粘液（生物膜材料）的良好生产者，基于滴流过滤器的废水处理系统由含有粘液物质的固定岩石床组成，这就是为什么产生粘液的细菌可能在这种类型的废水处理系统中有用。
除了上述生物技术潜力外，腐生链球菌的一些菌株具有高活性的有机溶剂稳定脂肪酶。
有机溶剂稳定的脂肪酶用于食品，乳制品、化妆品、洗涤剂、纺织和生物柴油工业等各种行业，以及精细化学品和新型高分子材料的合成以及环保工业。
«——【·芽孢杆菌属·】——»
Dk2和Dk4分离株是运动的、革兰氏阳性、杆状、过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性、孢子形成，营养琼脂上有奶油色菌落。
通过形态学和生化检测、API系统和16S rRNA基因序列分析，将这两种分离株鉴定为芽孢杆菌属，类芽孢杆菌属的一些成员以某种方式与昆虫死亡有关。
有些芽孢杆菌属（例如杨树、杨叶疟原虫和幼虫）对昆虫具有致病性，分离物Dk2和Dk4也已从不同的昆虫中分离出来，并已研究了昆虫的致病潜力。
类芽孢杆菌物种已被用作生物控制剂，例如，已将白杨菌菌株K165应用于棉花黑根腐病病原体根黑腐病菌；芽孢杆菌菌株 K165，对抗橄榄树黄萎病；多粘菌E681，用于预防阻尼病和枯萎病和多粘假单胞菌cw，对抗番茄和红辣椒白粉病。
另一方面，芽孢杆菌是一些最具工业意义的兼性厌氧菌，它们的自然栖息地包括土壤、根际和作物植物的根部，以及海洋沉积物。
尽管我们对它们的基因组信息了解有限，但在过去20年左右的时间里，人们对它们的生态和生物技术作用的学术兴趣有所增加。
多粘类芽孢杆菌具有许多不同的特征，如固氮，促进植物生长、磷的增溶、胞外多糖的生产、水解酶、抗生素、细胞分裂素和其他有价值和有用的化合物，如光学活性2,3-丁二醇，其他芽孢杆菌菌株可促进絮凝并增强土壤孔隙度。
«——【·荧光假单胞菌·】——»
Dk3分离株为革兰氏阳性、非孢子形成、非运动、杆状、过氧化氢酶和氧化氢酶阳性，营养琼脂上有奶油色菌落。
根据应用的测试电池，它被鉴定为荧光假单胞菌，据报道，荧光假单胞菌菌株可产生具有杀虫特性的代谢物，例如HCN和脂肽粘稠素和奥磷酰胺。
有趣的是，一些植物根系定植假单胞菌对昆虫具有致病性，并已被提议作为针对食根昆虫的新型生物杀虫剂进行潜在开发。
关于假单胞菌杀虫活性的发生和分子基础的积累知识，以及如何在害虫管理的综合框架内将这种性状用于新的基于根的昆虫控制方法。
在以前的研究中，已从不同的昆虫中分离出荧光假单胞菌，并已研究了昆虫的致病性，虽然没有关于使用荧光假单胞菌作为对抗栗子的生物控制剂的文献，但它已被用作针对其他一些有害生物的生物控制剂，特别是植物病原真菌和细菌。
荧光假单胞菌Pf29可用于控制小麦根系上的禾谷真菌，一些荧光假单胞菌菌株也被用作烟草苗床中立枯丝核菌的生物防治剂，现场常见的结痂症状和三种植物病原真菌，最终植物为大叶菜豆和米蕊草。
除了生物防治研究外，荧光假单胞菌还被用于许多其他生物技术应用，例如环状脂肽抗生素，Al、Ga和Ca等金属的解毒和生物修复、荧光颜料生产和吩嗪生物合成。
所有这些生物害虫防治和分离，细菌菌株及其密切相关物种的其他生物技术应用的例子都强烈表明，这里研究的来自栗瘿蜂的四种细菌分离株也可能具有如此有价值的特性。
«——【·结论·】——»
到目前为止，还没有关于从栗瘿蜂中分离和表征细菌的报告，确定为腐生链球菌（Dk1）、芽孢杆菌属（Dk2和Dk4）和荧光假单胞菌（Dk3）的四种分离株属于已知具有实际重要性的物种和属。
对相关文献的调查表明，所有四种分离株都具有用于不同生物技术应用的前景，今后的研究应侧重于研究其生物控制特性和生物技术应用的可能性。
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