western blot(WB)实验中如何选择合适的一抗和二抗

此由 广州莱德盟生物科技有限公司1号实验助手 整理

抗体分类：

根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。 轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。

二抗

二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。

如何选择二抗

根据一抗种属及类型选择合适的二抗。广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗。检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：

【一抗的种属来源】

二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。

【一抗的类别亚型】

二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。

【二抗的种属来源】

一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。有相应的驴来源的二抗，非常适合做类似双标的免疫实验。

【二抗的耦联标记】

一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。

【是否经过血清吸附过的二抗】

检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果您对实验的特异性要求很高，那我们向您推荐经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最低。

一抗

检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适的抗体，需要考虑如下几种因素： 分析试验应用的类型l 样本蛋白的结构性质l 样本的种属l 抗体宿主的种类l 抗体的标记和检测l

1.分析试验应用的类型

一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。

2.样本蛋白的结构性质

了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑

待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。l 样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来。

3.样本的物种

应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy和 NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。

4.一抗宿主物种的选择

一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大，如对不含IgG的细胞裂解物样本的western blotting检测，尽管如此，含有血清的组织裂解物和组织培养上清中含有免疫球蛋白，还原变性样本中含IgG，在western blot检测中则结合出现IgG分子50 and 25 kDa的重链和轻链条带。

经过吸附处理的二抗：不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构，抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应，一次有些二抗经过了动物或人类IgG吸附处理，以减少非特异性背景。例如，如果是小鼠的组织或细胞，那么选择经小鼠血清或IgG吸附处理过的二抗可以减少非特异性结合。但是此种抗体识别表位的数量被大大减少。

以下摘自丁香园战友的观点，可以作为参考：

@frankcai，认为：一般来说单抗的特异性好，杂带少；多抗通常便宜点，而且比较容易砸出来，因为很多时候要考虑到蛋白的剪切。我的建议是选大公司，口碑好的品牌，注意查阅说明书，对比自己的实验体系。

@boom，认为：检测的是蛋白的磷酸化，应该用单抗。

@关灯 ，认为：单抗当然最好，好象价格比较贵的说，其实现在很多人也都用多抗。我做过多抗，效果也还可以。你考虑下价格吧，如果有钱就买单抗。

@johnsonchau，认为：首选CST，效价高，特异性也可以，价格适中；abcam最全，价格较高；santa的性价比比较高，种类齐全；millipore旗下的chemicon和upstate也非常好。我觉得多克隆抗体更常见更实用。

@yihui88117，认为：一般是单抗好于多抗！很多公司都有抗体买！国外的抗体要比国内的抗体好一点！但是象乙肝E抗体我觉的没有必要买国外的，因为太贵了！

@acong8186认为：做免疫印迹已经两年多，用过了各种各样的抗体包括多种国产抗体。总体来说单抗出现条带比较干净，多抗没见的比单抗容易出结果，况且多抗非常容易出现非特异性条带。不推荐使用多抗。如果根据经济条件的话，推荐使用最新被abcam收购的兔单抗公司的抗体，价格在2000左右，比较实惠，很好用；尤其不推荐santa cruz的抗体，不管是单抗还是多抗。磷酸化抗体必须是单抗的，CST是做磷酸化起家的，但是现在其他公司的磷酸化抗体也比较不错，兔单抗、abcam、invitrogen旗下的几个公司等等，看你的运气和选择了。选择多抗的话如果一开始做不出来结果还比较浪费，多抗摸浓度摸条件所浪费的金钱，我觉得比直接买单抗耗费的金钱少不了很多，所以比较推崇单抗。曾经申诉过CST公司的磷酸化ERK和NF-KB的抗体，给调剂换货了，还行。其他比较常用的抗体入内参抗体，选择国产的还比较靠谱，我们的actin就是中山金桥的，觉得还不错。总之，做western不推荐使用多抗，单抗比较好，western条件成熟，条带比较容易出结果。如果是做免疫组化的话，可以选择santa cruz的多抗，的确很有优势，其抗体量多，染出来的片子很好看，颜色挺重，比较推荐使用。

@wh2008推荐的一抗选择原则：

1. 先查一下该抗体的相关专业外文文献，先看看前人一般选择哪家公司的哪种抗体较多，且一定要根据期刊质量和图片结果好坏综合判断，提供参考；

2. 若未找到相关文献或查到的文献信息不详等原因，也可以通过公司查找，如Santa Cruz、CST、abcam、chemicon、upstate、millipore等知名品牌公司。其中磷酸化抗体优先考虑CST公司；

3. 种属反应性的选择（species reactivity）：对应抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原，如Mouse、Rat、Human等。

4. 应用范围的选择：是用于Western blotting，或免疫组化IHC、免疫荧光IF、免疫沉淀IP等；甚至表明石蜡切片IHC-P或冰冻切片。

5. 单克隆和多克隆抗体的选择：由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现杂带。我习惯选择多克隆抗体，因为考虑其它几个问题后。

6. 种属来源：Mouse、Rat、Human、Goat等，这与你实验室有哪种对应的二抗多来选择即可。

7. 生产厂家的选择：如santa Cruz公司一抗一般1 ml （浓度为200 ug/ml），价格1900-2100元，性价比较高，但相比其它著名公司，抗体投诉率较高；而CST、Abcam、chemicon等公司一抗一般100 ul （浓度为1 mg/ml），价格2000-4000元。

8.选择国产、国外原装、国外进口分装？我们组只要actin内参购买博士德或博奥森等公司；若一抗是课题组多位学生甚至长期持续做的话，建议购买国外原装；若仅仅某届同学做一次，建议进口分装。

以上，选择抗体的时候如果已经有大量的文献报道了，就选择报道文章中的抗体品牌的一抗和二抗，一般不会有问题，如果实在没有条件或者实验需要，就花点心思在找靠谱的抗体上。合适的抗体对于wb来说真的是事半功倍。