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前言：

研究中使用含有精氨酸和苏氨酸衍生物的偶氮苯基团作为光响应位点的铜(II)配合物，并将其与鸡蛋白溶菌酶结合，以改变配合物在蛋白质中的构象。通过多种光谱研究，明确观察到氨基酸残基中的氮原子与顺磁性铜(II)离子结合，而紫外光照射则证实了配体的偶氮苯基团发生光异构化。使用光谱和计算方法来考虑结合模式，尽管目前还没有完全的晶体学验证。

一、介绍

通过将非天然金属离子或人工合成的金属配合物与蛋白质结合，对具有新的催化活性、化学功能和反应性的人工金属蛋白质进行了积极的研究。这些特性在自然界中找不到这种人工金属蛋白质有望具有广泛的应用，包括具有电子、磁性和医学特性的催化剂和生物材料。

构建人工金属蛋白质的主要策略有四种：将金属配合物配位到蛋白质的策略；用不同的金属替换原先包含在金属蛋白质中的金属的方法；通过超分子相互作用（如氢键）固定蛋白质的策略；通过配体功能基团和蛋白质功能基团之间的共价键结固定的策略。

偶氮苯是最常用的光开关之一，因其具有高量子产率、稳定性和易于合成和衍生化的特点。由于光异构化的波长位于紫外-可见（UV-vis）区域（E → Z：380 nm，Z → E：> 400 nm），可能对细胞和组织有害，因此在医学应用中引起了强烈的关注。与对长波长异构化作用的研究并行进行的是，许多研究也在将偶氮化合物与蛋白质结合以赋予光响应性。在以前的研究中，认为偶氮金属配合物能够控制可能影响SOD等因子的氧化还原电位。还有研究构建了一个分子同步系统，通过铜（II）/铜（I）氧化还原反应来控制结合和解离，但实际应用于蛋白质的研究例子很少。

二、研究实验

在研究中通过将具有高量子产率和光稳定性的偶氮苯基团作为光响应位点引入含有氨基酸配体的席夫碱铜（II）配合物中，通过将具有高量子产率和光稳定性的偶氮苯基团作为光响应位点引入含有氨基酸配体的席夫碱铜（II）配合物中，研究了蛋白质（鸡蛋白溶菌酶）的光响应性。

从计算化学的角度着手，通过分子设计的方法选择与溶菌酶结合的氨基酸配体。主要通过光谱方法评估溶液中溶菌酶和铜（II）配合物的结合情况。

化学试剂从Sigma-Aldrich、WAKO和TCI购买。所有试剂均为最高商业纯度，未经进一步纯化即可使用。

红外（IR）光谱在298 K下在JASCO FT-IR 4200光谱仪上记录，范围为4000-400 cm^−1。紫外-可见（UV-Vis）光谱在298 K下使用JASCO V-570光谱仪测量，范围为800-250 nm。圆二色（CD）光谱使用JASCO J-725仪器在298 K下测量。荧光光谱在298 K下使用JASCO FP-6200光谱仪测量。配合物的电子顺磁共振（EPR）光谱在77 K下使用Bruker EMX-nano EPR光谱仪（X波段）记录。

配合物的电化学性质通过循环伏安法（CV）在0.1 M磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）中测量，工作电极、对电极和参比电极分别使用玻碳、铂线和Ag/AgCl电极，在ALS/DY2323 BI-POTENTIOSTAT下进行。CV曲线在室温下，氮气气氛下进行三个循环测量，电位扫描速率为5-200 mV/s。

CuAT-Imi：将偶氮苯-水杨醛[6]（226毫克，1.00毫摩尔）和L-苏氨酸（119毫克，1.00毫摩尔）溶解在甲醇（100毫升）中，313K下搅拌1.5小时，得到红色溶液。加入醋酸亚铜水合物（199毫克，1.00毫摩尔）搅拌1小时，然后加入咪唑（68毫克，1.0毫摩尔）再搅拌1小时，得到深绿色溶液。

反应溶液在298K下静置4天，得到绿色针状晶体。产率：0.325克（73.36%）。分析结果：C；48.21% H；5.15% N；20.45% 计算结果：C20H19N5O4Cu∙2H2O 发现结果：C；48.36% H；4.97% N；19.85%。

CuAA-Imi：将偶氮苯-水杨醛[6]（226毫克，1.00毫摩尔）和L-精氨酸（174毫克，1.00毫摩尔）溶解在甲醇（100毫升）中，313K下搅拌1.5小时，得到红色溶液。加入醋酸亚铜水合物（199毫克，1.00毫摩尔）搅拌1小时，然后加入咪唑（68毫克，1.0毫摩尔）再搅拌1小时，得到深绿色溶液。

反应溶液在298K下静置4天，得到绿色针状晶体。产率：0.325克（73.36%）。分析结果：C；52.06% H；4.26% N；15.18% 计算结果：C20H19N5O4Cu∙0.25H2O 发现结果：C；52.15% H；4.10% N；15.18%。

使用Gaussian09软件在GaussView上对19种偶氮苯-L-氨基酸席夫碱铜配合物模型进行了量子化学计算。所进行的计算包括结构优化、振动计算和激发态计算。使用B3LYP作为泛函，分别应用于Cu和CHNO。通过逐步增加CHNO从3-21 g、6-31 g和6-31 g（D），提高了结构优化和振动计算的准确性。

在Cu原子的计算中，通过指定有效的核心势（ECP），通过用价电子感受到的来自核心电子的势能替代核心电子的影响，从而减少计算量。LanL2DZ既用于价电子的基组，也用于ECP的基组。

使用GOLD软件对溶菌酶进行了与配体的对接模拟计算。从PDB网站中选择了5个溶菌酶的结构（lyt），并通过DFT计算对配体复合物的结构进行了优化。所有存在于5 lyt中的水分子都被去除，判断它们不参与对接过程。

配体对接的范围是整个溶菌酶，确定最佳的对接位点。选择GoldScore作为评分函数，以氢键和范德华力作为计算的主要元素进行计算。根据GoldScore值，将确定哪些复合物对于与溶菌酶的对接是有效的。对接过程使用遗传算法，并将试验次数设置为30次。

三、研究分析

通过使用KBr片法对复合物的结构进行了FT-IR光谱表征。在1629到1635 cm−1范围内观察到与CuAA、CuAT（未与溶菌酶结合的缺失咪唑咯）以及CuAA-Imi和CuAT-Imi的亚胺ν（-C=N）振动相对应的吸收峰。

在1382到1392 cm−1范围内还观察到与ν（-COO）振动相对应的吸收峰。这些分配与类似化合物[6]类似。与DFT计算的模拟红外光谱相比，ν（-C=N）振动尤其在1656到1669 cm−1的范围内观察到，与实验结果相对应。这表明了所有四个复合物的确认，以及从粉末X射线图样中的初步晶体结构（未显示）。

在280 nm激发光下的二维荧光光谱中，CuAA的最大荧光波长从407 nm增加到415 nm，CuAT的最大荧光波长从407 nm增加到414 nm，添加了铜(II)复合物。观察到长波长的移动。

这是由于末端的-OH基团脱质子化为酪氨酸酸根位点Tyr20和Tyr23，溶菌酶的氨基酸残基，或者铜(II)复合物直接与Tyr残基的-OH基团配位。荧光强度猝灭暗示了溶菌酶和铜(II)复合物CuAA和CuAT的结合。

为了进一步了解荧光猝灭机制，使用Stern-Volmer方程的常规关系对获得的荧光数据进行了分析，显示了良好的线性关系。这表明存在单一的猝灭机制（静态或动态）。这些结果表明了铜(II)复合物与溶菌酶的结合。

使用CD和UV-vis光谱对溶液中溶菌酶的二级结构变化进行了研究，以调查这些复合物与蛋白质二级结构的结合后的变化。溶菌酶的CD光谱（未显示）通常在208 nm处显示最强的负吸收带，并在222 nm左右显示一个肩峰，这是α-螺旋和β-折叠结构蛋白质的特征。

在研究中添加了多达2当量的CuAA和CuAT，但在208 nm和222 nm周围的波长处未观察到光谱的显著变化，这些波长是溶菌酶二级结构所导致的。由此可推断，通过添加这些复合物，溶菌酶的二级结构得到了维持，并且溶菌酶和复合物结合的位点不会影响蛋白质的二级结构。

通过UV-vis光谱评估了溶菌酶和铜复合物在溶液中（醋酸盐缓冲液）的相互作用。CuAA中对应于铜(II)的d-d跃迁的吸收波长在溶菌酶浓度增加时从666 nm移至652 nm，类似于CuAA-Imi的短波长位移。这表明CuAA的铜(II)离子与溶菌酶的组氨酸（或含氮原子）残基的咪唑咯基团结合。

在构成溶菌酶的残基中，只有一个组氨酸（His15）位于溶菌酶活性位点裂隙的对面。CuAA可能被认为与溶菌酶表面的His15结合。还显示了复合溶液中偶联苯偶联基团的光异构化结果。在与溶菌酶混合溶液中，CuAA和CuAT在紫外光照射后的峰值减少（由于偶联苯的顺式形式），可见光照射后的峰值增加（由于偶联苯的反式形式）。光异构化不能完全可逆。

在复合溶液中的结合模式中CuAA和CuAA@Lysozyme的ESR光谱在−196˚C下记录，分析了顺磁性（S = 1/2）铜(II)位点的配位环境。CuAA的ESR光谱显示了一个宽广的信号，gparallel = 2.257，gperpendicular = 2.056，而CuAA@lysozyme的gparallel = 2.268，gperpendicular = 2.077，显示了金属原子周围的平面或方锥形结构。

CuAT的ESR光谱显示了一个宽广的信号，gparallel = 2.269，gperpendicular = 2.062，而CuAT@Lysozyme的gparallel = 2.272，gperpendicular = 2.082。对于CuAA，Aparallel的值为187.5 G，对于CuAA@lysozyme，为176.8 G，对于CuAT，为183.7 G，对于CuAT@Lysozyme，为175.2 G。

观察到的大值和gparallel小于蓝铜蛋白的值的特征，与Type-2铜蛋白的ESR光谱非常相似，表明铜(II)复合物是平面的。它可以在保持方锥形结构的同时与溶菌酶结合。

溶菌酶水溶液的循环伏安图（CV）单独没有显示出氧化还原峰。CuAA（CuAT，CuAA@Lysozyme）的CV在氧化和还原波中都显示出明显的峰。CuAT和CuAT@Lysozyme的CV显示出不同的形状，这表明几乎没有铜(II)复合物从溶菌酶中释放出来。

CuAA峰的还原波（Ia）和氧化波（Ib）的值相对于E = 0.116 V，−0.459 V vs. Ag/AgCl（饱和KCl水溶液，以下简称为KCl），0.315 V，−0.260 V vs. NHE，以及CuAA@Lysozyme。

还原波（Ia’）和氧化波（Ib’）的值相对于−0.067 V，−0.447 V vs. Ag/AgCl（KCl），0.132 V，−0.248 V vs. NHE。CuAT的峰还原波（Ic）和氧化波（Id）的值相对于E = 0.020 V，−0.365 V vs. Ag/AgCl（KCl），0.219 V，−0.166 V vs. NHE。波Ic’和氧化波Id’的值分别为−0.012 V，−0.472 V vs. Ag/AgCl（KCl），0.187 V，−0.271 V vs. NHE。

CuAT复合物在溶菌酶存在下随着扫描速率增加，使得氧化和还原峰变得不清晰。从这些结果可以看出，溶菌酶添加后，CuAT复合物峰电流的减小是由于整个溶液黏度的增加和CuAT复合物与庞大且扩散速率较慢的溶菌酶的结合导致的。

四、结论

通过荧光猝灭确认后，溶菌酶的氨基酸残基在280 nm激发下显示了300-400 nm的荧光，表明附近存在铜(II)复合物。荧光波长向长波方向移动是由于色氨酸环中的-NH-或酪氨酸末端的-OH上的质子脱离。溶菌酶的体积阻碍了铜(II)和电极间的电子传递，导致总体电流值在循环伏安实验中降低。

ESR光谱表明溶菌酶共轭前后，铜(II)复合物的配位环境发生了变化。UV-vis测量证实即使在复合物溶液中，铜(II)复合物也发生了光异构化。结合模式通过计算化学考虑，而晶体学验证结果将在其他地方展示。

参考文献

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2：Stappen等人在《Chemical Reviews》2022年的论文中，通过超越一次配位层的环境调控，设计了人工金属酶。该论文探索了这一新领域的挑战和机遇。

3：Dabis和Ward在《ACS Central Science》2019年的论文中，讨论了人工金属酶的挑战和机遇。他们提出了设计和应用人工金属酶的方法和策略。

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