如何利用shRNA实现基因沉默？

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利用 shRNA（短发夹 RNA）实现基因沉默主要包括设计 shRNA 序列、构建表达载体、导入细胞以及验证基因沉默效果等步骤，以下为你详细介绍：

1. 设计 shRNA 序列

• 选择靶基因区域：首先要明确想要沉默的靶基因，选择其 mRNA 上合适的区域作为靶点。一般选择靶基因编码区的特定序列，避免选择具有高度同源性的区域，以减少脱靶效应。通常靶点序列长度为 19 – 29 个核苷酸。设计 shRNA 序列：根据选定的靶基因序列，设计 shRNA 序列。shRNA 包含一段与靶基因互补的正义链、一个 loop 环序列和一段与正义链互补的反义链。loop 环的长度和序列有多种选择，常见的 loop 序列如 TCAAGAGA 等。可以借助专门的生物信息学工具（如 Ambion 的 siRNA Target Finder 等）辅助设计，提高设计的准确性和有效性。评估脱靶可能性：使用在线工具（如 BLAST）对设计好的 shRNA 序列进行比对，评估其与非靶标基因的同源性，尽量选择脱靶可能性低的序列。

2. 构建表达载体

• 选择载体：常用的载体有质粒载体和病毒载体（如慢病毒载体、腺病毒载体及腺相关病毒载体等）。质粒载体操作相对简单，适用于瞬时转染实验；病毒载体转染效率高，能实现稳定的基因表达，适合长期的基因沉默研究。合成寡核苷酸：根据设计好的 shRNA 序列，合成对应的寡核苷酸单链，然后退火形成双链 DNA 片段，该片段两端带有与载体相匹配的粘性末端。连接载体与片段：使用限制性内切酶对载体进行酶切，使其产生与双链 DNA 片段互补的粘性末端。然后用 DNA 连接酶将双链 DNA 片段连接到载体上，构建成含有 shRNA 编码序列的重组表达载体。转化与筛选：将重组表达载体转化到大肠杆菌中，通过抗生素筛选含有正确重组载体的菌落。提取质粒 DNA，进行测序验证，确保 shRNA 序列正确插入载体。

3. 导入细胞

• 转染或感染细胞
• 质粒载体：如果使用的是质粒载体，可以采用脂质体转染、电穿孔等方法将重组质粒导入细胞。脂质体转染操作简便，对细胞毒性相对较小；电穿孔法适用于一些难转染的细胞，但可能对细胞有一定损伤。病毒载体：若使用病毒载体，需要先将重组载体转染到包装细胞中（如 293T 细胞），产生携带 shRNA 的病毒颗粒。然后用这些病毒颗粒感染目标细胞，感染效率通常较高。
• 筛选稳定转染或感染的细胞：对于需要长期稳定沉默基因的实验，可利用载体上的筛选标记（如抗生素抗性基因）对转染或感染后的细胞进行筛选，获得稳定表达 shRNA 的细胞克隆。

4. 验证基因沉默效果

• 检测 mRNA 水平：采用实时荧光定量 PCR（qRT – PCR）技术，检测靶基因 mRNA 的表达水平。与未处理的对照组细胞相比，如果靶基因 mRNA 水平显著降低，说明 shRNA 发挥了沉默作用。检测蛋白水平：通过 Western blot、免疫荧光等方法检测靶蛋白的表达水平。若靶蛋白表达量明显下降，进一步证实基因沉默效果。观察细胞表型变化：根据靶基因的功能，观察细胞在生长、增殖、凋亡、分化等方面的表型变化，以验证基因沉默对细胞生物学行为的影响。