自噬研究指南|线粒体自噬作用机制详解

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上期文章主要介绍了线粒体自噬的主要过程和分类，本期将对线粒体自噬作用机制做详细介绍。线粒体自噬主要依赖两种通路：泛素依赖通路和非泛素依赖通路，示意图见图1。

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图1 线粒体作用机制[1]

泛素化依赖通路

泛素化依赖通路即依赖于线粒体表面蛋白的泛素化来促进线粒体自噬，PINK1/Parkin通路是目前研究最深入的泛素化依赖通路。PINK1是一种高度保守的线粒体蛋白，参与线粒体功能的调节。Parkin是一种E3泛素连接酶，负责连接Ub分子和底物蛋白，带有Ub标签的底物蛋白会被蛋白酶识别并降解。

正常线粒体中，PINK1会在线粒体靶向序列的引导下进入线粒体内膜，随后被位于线粒体基质和内膜上的蛋白酶（MPP、PARL）切割，再被释放到胞质中被泛素-蛋白酶体水解。而在受损线粒体中，线粒体去极化，膜电位降低，PINK1聚集在线粒体膜表面，通过Parkin及其底物Ub在Ser65位点的磷酸化（pSer65-Ub）激活Parkin E3泛素连接酶活性[2]。pSer65-Ub在线粒体外膜上积累可触发自噬受体OPTN和NDP52对自噬起始因子（如ULK1、DFCP1等）的募集，促进线粒体自噬。另外，有研究发现p62（自噬相关连接蛋白）在线粒体自噬中也发挥了重要作用，敲低p62不影响Parkin的募集，但会影响受损线粒体的清除[3]。除了激活Parkin招募自噬受体外，PINK1还可以通过泛素磷酸化直接募集OPTN和NDP52促进线粒体自噬[4-5]。

非泛素化依赖通路

这一种通路主要由自噬受体介导，它们不经泛素化直接与LC3结合，从而启动线粒体自噬。在哺乳动物中，这些受体位于线粒体外膜，主要包括NIX（也称为BNIP3L）、BNIP3、FUNDC1蛋白（见图1）。

NIX蛋白可通过其BH3结构域直接与LC3结合，诱导线粒体自噬。BNIP3与NIX同属于抗凋亡B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族的亚家族，包含BH3结构域，因此同样可直接与LC3结合。小鼠神经元细胞敲除BNIP后，研究人员发现NIX表达上调，但线粒体自噬水平仍明显降低，NIX上调并不能弥补BNIP缺失的后果[6]。

FUNDC1可通过与LC3相互作用诱导低氧下哺乳动物细胞的Parkin非依赖性线粒体自噬。虽然FUNDC1介导的线粒体自噬不依赖于Parkin，但另一种线粒体E3泛素连接酶MARCH5可通过泛素化降解FUNDC1来调节缺氧条件下的线粒体自噬[7]。此外，FUNDC1诱导的线粒体自噬还受磷酸化的调控。有研究报道在心肌缺血/再灌注损伤模型中，FUNDC1去磷酸化激活线粒体自噬，而丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）可抑制FUNDC1介导的线粒体自噬进而促进心肌细胞凋亡，证明磷酸化参与调控FUNDC1介导的线粒体自噬[8]。

有效清除受损或冗余的线粒体也是维持细胞内环境稳定的关键，为助力线粒体自噬的研究，汉恒生物研发了多种线粒体自噬工具（详见表1）。

表1 汉恒生物线粒体自噬研究工具

EGFP-LC3单标记的荧光探针可以监测 LC3 蛋白参与自噬起始过程，Mito-dsred线粒体特异性定位荧光探针可定位线粒体，两者共转染细胞即可准确实时地追踪线粒体自噬的动态过程。自噬通路单标研究工具Parkin-EGFP、Bnip3-EGFP、Nix-EGFP、FUNDC1-EGFP，与Mito-dsred线粒体共感染目的细胞可鉴别相关信号分子的线粒体转位。mt-Keima、Cox8a-EGFP-mcherry可独立应用于线粒体自噬的研究。

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线粒体自噬如何研究？

参考文献

[1]Lu, Yingying., Li, Zhijia., Zhang, Shuangqian., Zhang, Tongtong., Zhang, Tongtong.. Cellular mitophagy: Mechanism, roles in diseases and small molecule pharmacological regulation. Theranostics, 2023, .

[2]Riley, B E., Lougheed, J C., Callaway, K., Velasquez, M., Brecht, E.. Structure and function of Parkin E3 ubiquitin ligase reveals aspects of RING and HECT ligases. Nature communications, 2013, 4.

[3]Geisler, Sven., Holmström, Kira M., Skujat, Diana., Fiesel, Fabienne C., Rothfuss, Oliver C.. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature cell biology, 2010, 12(2):119-31.

[4]Lazarou, Michael., Sliter, Danielle A., Kane, Lesley A., Sarraf, Shireen A., Wang, Chunxin.. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature, 2015, 524(7565):309-314.

[5]Richter, Benjamin., Sliter, Danielle A., Herhaus, Lina., Stolz, Alexandra., Wang, Chunxin.. Phosphorylation of OPTN by TBK1 enhances its binding to Ub chains and promotes selective autophagy of damaged mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(15):4039-44.

[6]Shi, Ruo-Yang., Zhu, Sheng-Hua., Li, Victor., Gibson, Spencer B., Xu, Xing-Shun.. BNIP3 interacting with LC3 triggers excessive mitophagy in delayed neuronal death in stroke. CNS neuroscience & therapeutics, 2014, 20(12):1045-55.

[7]Chen, Ziheng., Chen, Ziheng., Liu, Lei., Cheng, Qi., Cheng, Qi.. Mitochondrial E3 ligase MARCH5 regulates FUNDC1 to fine-tune hypoxic mitophagy. EMBO reports, 2017, 18(3):495-509.

[8]Zhou, Hao., Zhu, Pingjun., Guo, Jun., Hu, Nan., Wang, Shuyi.. Ripk3 induces mitochondrial apoptosis via inhibition of FUNDC1 mitophagy in cardiac IR injury. Redox biology, 2017, 13:498-507.